В отличие от общепринятых представлений хромосомы и плазмиды у бактерий могут иметь не только кольцевую, но и линейную структуру. Некоторые бактерии содержат, по крайней мере, две различные хромосомы на клетку. Рассмотрены примеры других неординарных особенностей генома у отдельных представителей бактерий.



Общеизвестно, какой огромный вклад в генетику внесло изучение бактерий. Начиная с 40-х гг. нашего столетия, стремительно накапливались новые факты – не только общего значения, но и относящиеся к собственно бактериальному геному. Львиная доля соответствующих работ была проделана на близкородственных бактериях кишечной группы – Escherichia coli и Salmonella typhimurium, и на представителе бацилл – Bacillus subtilis (точнее, на производных одного-единственного штамма Вас. subtilis 168). На основании конъюгационных, трансдукционных и трансформационных скрещиваний, а также экспериментов по слиянию протопластов были составлены генетические карты, позднее согласованные с физическими картами и нуклеотидными картами от­дельных районов бактериальной хромосомы; в настоящее время заканчиваются комплексные работы по составлению нуклеотидных карт всей хромосомы некоторых видов бактерий. Исследования с применением цитохимических и биохимических методов дали возможность построить схемы "укладки" хромосомы в бактериальной клетке, и взаимодействия ее с белками разных типов; эти же исследования, сопряженные с генетическими методами, позволили изучить механизмы репликации основных компонентов клеточного генома - хромосомы и плазмид. Постепенно выкристаллизовались определенные представления о строении генома бактериальной клетки. Эти представления могут быть сведены к следующим Положениям.

Бактериальная клетка имеет хромосому – нить ДНК, уложенную в компактную структуру – нуклеоид. В зависимости от метода микроскопирования, способа фиксации и т.д. нуклеоид выглядит как овальное тельце, боб, моток спутанных нитей. Видимо, правильнее всего представлять себе нуклеоид в виде кораллоподобной структуры с рогами-выступами, или в виде кочана цветной капусты. По крайней мере, так реконструируется нуклеоид на основании электронной микроскопии, с применением иммуноокрашивания, серии срезов замороженных бактерий. В такой конфигурации ДНК нуклеоида-хромосомы удерживается гистоноподобными белками и молекулами РНК. "Размотанная" хромосомная ДНК имеет замкнутую кольцевую структуру. Репликация этого кольца всегда начинается в определенной области, OriС, и идет в основном симметрично по правому и левому полукружию хро­мосомы к конечной точке, ТегС. Там обе волны репликации встречаются. Строение области OriС и порядок расположенных на ней генов в значительной мере консервативно, т.е. присуще всем изученным бактериям. Строение области ТегС также специфично; назначение расположенных там блоков генов – тормозить репликацию. Бактерии гаплоидны, т.е. имеют лишь один набор хромосомных генов. Более того, весь этот набор умещается на одной-единственной хромосоме. Однако кроме хромосомы в клетке могут содержаться самостоятельные репликоны, обычно не­больших размеров – плазмиды. Плазмиды также имеют кольцевую ДНК. Функционирование генов, расположенных на плазмидах, для существования клетки необязательно, хотя в некоторых условиях способствует ее выживанию. Репликация кольцевой хромосомы плазмид может происходить как по типу хромосомной репликации (так называемый тета-тип репликации), так и другими способами.

Многие из этих положений сохранили свое значение и универсальность до настоящего времени; однако в некоторые из них внесены поправки – как за счет привлечения новых бактерий-моделей, так и из-за усовершенствования способов изучения традиционных объектов. В настоящем обзоре в основном будут рассмотрены данные, показывающие, что, по крайней мере, три "догмы" не могут считаться общими для всех бактерий. Имеется в виду наличие лишь кольцевых хромосом; наличие лишь кольцевых плазмид; расположение всех генов лишь на одной-единственной хромосоме.

Как и в любой другой области биологии, открытие новых особенностей строения бактери­ального генома зависело как от разнообразия изучаемых бактерий, так и от употребления новых методик. Очень важным методом для изучения генома бактерий и плазмид явился рестрикционный анализ, и построение на его основе, наряду с генетическими, физических карт их ДНК. До начала 80-х гг. применяли рестриктазы, опознающие главным образом четырехчленные комбинации нуклеотидов (так называемые мелкощепящие рестриктазы), и однонаправленный электрофорез. Это давало хорошие результаты для построения карт плазмид небольших размеров, так как после обработки рестриктазами возникало сравнительно небольшое число легко опознаваемых на электрофореграммах фрагментов. Однако мелкощепящие рестриктазы совершенно не годились для построения рестрикционных карт бактериальных хромосом, превышающих размеры небольших плазмид в сотни раз - на электрофореграммах возникал "частокол" из множества сливающихся полос. С другой сторо­ны, фрагменты, большие чем 50 тпн, плохо разделялись в обычном электрофорезе.

Выход был найден за счет применения крупнощепящих рестриктаз и пульс-фореза. Крупнощепящие рестриктазы узнают на молекуле ДНК комбинации нуклеотидов, включающие 6 и более оснований, и к тому же образующие редко встречающиеся сочетания. Это давало возможность получить, например, при обработке хромосомы Н. influenzae размером в 1834 тпн посредством ре­стриктазы Ара I 21 фрагмент ДНК (размером от 1,6 до 305 тпн), а при обработке посредством Sma I – лишь 16 фрагментов. Пульс-форезом называется форез в изменяющемся электрическом поле, когда катод и анод меняют свое расположение через определенные промежутки времени. Существует много схем проведения пульс-фореза, различающихся различным расположением полюсов относительно друг друга, частотой "пульса" и т.д. В условиях пульс-фореза можно разделить очень крупные фрагменты ДНК (свыше 10·10–3 тпн), так как они мигрируют в переменном электрическом поле с разной скоростью, в зависимости от их длины, конфигурации и массы. Существенное условие для выделения нативных хромосом и получения крупных фрагментов ДНК – щадящий способ лизиса кле­ток. В применявшихся раньше методиках ДНК обычно несла дополнительные разрывы за счет действия гидродинамических сил, и других причин. При щадящем способе лизиса клетки "вплав­ляются" в блок агарозы; их разрушение происходит in situ, ДНК непосредственно поступает в пла­стинку геля и движется в электрическом поле. Обработка рестриктазами, протеазами и т.д. происходит в тех же условиях.

Пульс-форез оказался очень удачным методом для изучения как хромосом эукариот, в осо­бенности дрожжей, обладающих мелкими линейными хромосомами, так и генома прокариот. С помощью пульс-фореза удалось впервые построить физические карты большого количества бактерий. Уже к 1992 г. было известно больше 10 бактериальных видов, у которых были построены такие карты, и впервые точно определен размер хромосом. К настоящему времени число таких видов возросло в 1,5…2 раза. У некоторых видов размеры хромосом были близки к ориентировочным оценкам, сделанным на основании определения среднего количества ДНК на нуклеоид, скорости ренатурирования ДНК, измерения контура хромосом под электронным микроскопом, подсчета расстояний между генетическими маркерами, и т.д. Однако в ряде случаев оценки, сделанные на основании какого-то одного из этих методов, и величины физических карт хромосом, полученных в результате пульс-фореза, могли довольно сильно различаться. Например, в уже цитированной работе с определением величины хромосомы Н. influenzae ее размеры оказались равны 1834 тпн, а по данным электронной микроскопии, приведенным в той же работе – 2250…2240 тпн.

В большинстве случаев хромосомы, как и ожидалось, оказались кольцевыми. Однако пульс-форез позволил обнаружить и принципиально новые особенности строения хромосом некоторых бак­терий, о чем и пойдет речь ниже.



ЛИНЕЙНЫЕ ХРОМОСОМЫ БАКТЕРИЙ

В 1989 г. была опубликована статья об изучении с помощью пульса-фореза нативной ДНК спи­рохеты из рода боррелий, Borrelia burgdorferi – возбудителя одного из видов клещевого спирохетоза, болезни Лимы. На электрофореграмме обнаруживалась полоса размером около 950 тпн. Соответствующая ДНК мигрировала в геле точно так же, как заведомо линейные хромосомы дрожжей, взятые в качестве контроля. Кольцевая хромосомная ДНК уже исследованных бактерий в примененных условиях опыта вообще не входила в гель (например, хромосомы различных видов микоплазм, хотя они имеют даже несколько меньшие размеры: 600…900 тпн). После обработки редкощепящими рестриктазами линейная ДНК В. burgdorferi разрезалась на несколько фрагментов, которые в сумме давали ту же величину – 950 тпн. Был сделан вывод о том, что эта крупная молекула ДНК и представляла собой нативную хромосому данной спирохеты. Возможность того, что такая структура сама может быть артефактом, например, фрагментом кольцевой хромосомы, разорванной в процессе лизиса клетки, опровергалась на том основании, что щадящие условия лизиса спирохет исключали такие разрывы. Столь нестандартный вывод о наличии у В. burgdorferi линейной хромосомы в какой-то мере был подготовлен тем, что у этой спирохеты уже были найдены линейные плазмиды достаточно большой величины (см. ниже). Впоследствии линейная структура хромосомы В. burgdorferi подтвердилась на различных клинических изолятах этой спирохеты. Линейная структура хромосомы сохранялась после множества пассажей культуры боррелий. Вместе с тем у других спирохет – лептоспир и трепонем организация хромосомы была кольцевой.

Другими бактериями, у которых были найдены линейные хромосомы, оказались актиномицеты. В отличие от спирохет генетика актиномицетов исследована достаточно хорошо. Для наиболее изученных видов еще с конца 50-х гг. составлялись на основании конъюгационных скрещиваний по­дробные генетические карты с множеством нанесенных на них маркеров. Эти карты были кольце­выми. Тем не менее недавно в процессе изучения крупных линейных плазмид S. lividans 66 было об­наружено, что обработка клеточной ДНК протеазой приводит к появлению в поле пульс-фореза очень больших молекул (размером в 8?106 пн), мигрирующих как линейные структуры. Они были в 15 раз больше некоторых линейных плазмид, хотя и имели с ними определенное сходство (см. ниже). На обоих концах таких структур располагались инвертированные повторы, и к ним были прикреплены белковые молекулы. Было сделано предположение, что каждая такая гигантская линейная структура и является хромосомой S. lividans, тем более что ее величина совпадала с величиной хромосомы, вычисленной при построении физической карты. Такие же структуры были обнаружены у шести других видов актиномицетов, в том числе у эталонного для генетики актиномицетов вида – S. coelicolor. Это противоречило, на первый взгляд, представлениям о кольцевой генетической карте актиномицетов, тем более что уже существовали физические кольцевые карты, составленные на основании разгонки в поле пульс-фореза ДНК, обработанной крупнощепящими рестриктазами. Но та­кое противоречие снималось допущением, что in vivo хромосома представляет собой кольцевую структуру, которая, однако, замкнута лишь за счет взаимодействия белковых молекул, расположенных на свободных концах, а не за счет непрерывного перехода правого полукружия хромосомы в левое. К тому же при построении физической карты S. lividans в участках стыка фрагментов, соответствующих концам, были обнаружены аномалии. Эти аномалии можно было объяснить существованием свободных концов ДНК у нативной хромосомы, не переходящих в непрерывную кольцевую структуру.

Генно-инженерными методами удалось получить штаммы S. lividans с истинными кольцевыми хромосомами. Это было достигнуто за счет введения в клетку актиномицетов плазмиды, содержащей депротеинизированные и искусственно "сшитые" между собой участки ДНК правого и левого концов. Вследствие рекомбинации с этой плазмидой в хромосоме оказались "выкинутыми" фрагменты ДНК, непосредственно связывающиеся с концевыми белками, а сама хромосома представляла собой теперь непрерывную кольцевую молекулу ДНК. Соответствующие клоны были жизнеспособны, хотя и обладали замедленной скоростью роста. Если ДНК из этих клонов обрабатывалась протеазой, то линейных структур не возникало.

Хромосома линейной конфигурации была также обнаружена еще у одной бактерии - фитопатогенной Rhodococcus fascians.

Наличие у некоторых бактерий линейных хромосом поставило ряд вопросов. Основные из них – каково строение свободных концов таких хромосом, и как происходит их репликация?

Оба типа линейных хромосом, у спирохет-боррелий и актиномицетов, оказались непохожими друг на друга. Как упоминалось выше, к обоим концам хромосомы актиномицетов были прикреплены белки. Если лизат клеток актиномицетов не обрабатывался предварительно протеазой, то фрагменты, соответствующие концевым участкам, не входили в гель. Удаление белков протеазой или их денатурирование додецилсульфатом делало возможным разгонку в пульс-форезе соответствующих фрагментов ДНК. Сиквенс концевых фрагментов показал, что примерно на протяжении 25 тпн их ДНК состоит из инвертированных повторов. При секвенировании крайних концевых участков было обнаружено, что среди первых 87 пар оснований встречается 4 палиндрома размером в 13…15 оснований. Такая структура хромосомы была очень похожа на хромосому фага 029, одного из фагов Вас. subtilis, и на ДНК аденовирусов (см. ниже). Большое сходство между хромосомой актиномицетов и ДНК фага 029 позволяло ожидать, что у актиномицетов, как и у этого фага, репликация начинается с концевых участков и оттуда идет к центру хромосомы. Однако у S. lividans и S. coelicolor была обнаружена область с последовательностями нуклеотидов, напоминающими "боксы" области OriС кишечной палочки и других бактерий, хотя и расположенными относительно друг друга в несколько ином порядке. Эта область у актиномицетов располагалась в центре хромосомы. О том, что ее функция была сходна с функциями OriС, свидетельствовало конструирование плазмидоподобной минихромосомы, включающей этот участок, но не концевые фрагменты; такая структура была способна к самостоятельной репликации в клетках актиномицетов. Видимо, у актиномицетов возможны оба типа репликации – как в направлении от концов к центру, так и от центра к концам. Это подтверждается упомянутой выше работой по созданию жизнеспособных клонов, лишенных связанных с белками концевых участков. По крайней мере, часть ДНК, входящая в состав этих участков, не является жизненно важной для клетки; именно здесь расположены области постоянных перестроек и очень крупных спонтанных делеций, не ведущих к утрате жизнеспособности. Возникновению перестроек, видимо, способствует и то обстоятельство, что здесь расположено много палиндромов и амплифицированных участков. Любопытно, что у Е. coli частота спонтанных рекомбинационных событий (выщепление профага X, из хромосомы) в районе ТегС возрастает в десятки тысяч раз. Область ТегС в какой-то мере можно уподобить концевым участкам линейных репликонов, если рассматривать кольцевую хромосому как структуру, разомкнутую в точке, противоположной OriС.

Линейные хромосомы спирохет-боррелий в отличие от актиномицетов лишены белков, при­крепленных к концам. Терминальные участки заканчиваются шпилечными структурами. Гены, гомологичные консервативным бактериальным генам dna N, dna A, gyr А и gyr В, расположены в центре хромосомы. Там же располагаются гены рибосомных РНК и рибосомных белков. Порядок их расположения напоминал порядок расположения гомологичных им генов у бактерий с кольцевой хромосомой, хотя несколько отличался от него. Видимо, репликация хромосомы начинается с центра линейной молекулы, и репликационные волны симметрично идут к обоим концам. Возможно, что исходная структура хромосомы предков боррелий была кольцевой, но в результате делеций она превратилась в линейную. При этом сохранился комплекс генов, характерный для OriС бактерий, но роль области ТегС взяли на себя концевые участки.



ЛИНЕЙНЫЕ ПЛАЗМИДЫ БАКТЕРИЙ

Линейные плазмиды бактерий были обнаружены раньше, чем линейные хромосомы. Впервые они были описаны у одного из видов актиномицетов в конце 70-х – начале 80-х гг. Эти плазмиды, pSLA 1 и pSLA 2, были размером несколько более 10 тпн. Они детерминировали синтез антибиотика ланкацидина. В клетке содержалось ~60 копий таких плазмид. Линейное строение их ДНК доказывалось следующим образом.

Во-первых, обработка рестриктазами давала такую комбинацию фрагментов, на основании ко­торой могла быть построена лишь линейная, но не кольцевая карта. Далее, два фрагмента не входили в гель при электрофорезе, если ДНК не была депротеинизирована проназой. Если ДНК была обработана фенолом и додецилсульфатом натрия, то эти фрагменты можно было найти на электрофореграммах, но их передвижение было аномальным. Лишь после депротеинизации они передвигались со скоростью, соответствующей их размерам. Нативная ДНК плазмид была устойчива к 3'-экзонуклеазе, но чувствительна к экзонуклеазе фага А (5'-экзонуклеаза). Все это свидетельствовало о том, что плазмиды были линейными, и на их свободных концах находились белки, прикрепленные к 5'-концам ДНК. Впоследствии было установлено, что на концах линейных плазмид S. rochei находятся многочисленные повторы длиной в несколько сот пар оснований. У плазмиды pSCL из клеток S. clavuligerus концевые участки с повторами, размером около 1 тпн, были очень похожи друг на друга; правый участок мог гибридизоваться с левым.

Линейные плазмиды сравнительно небольшой величины были обнаружены у ряда видов актино­мицетов. ДНК одной такой плазмиды, pSCL-1 из S. clavuligerus, была полностью секвенирована. Вся плазмида была размером в 11696 пар нуклеотидов (пн). На ее концах были обнаружены занимающие ~900 пн концевые инвертированные повторы, имеющие -70% гомологии с концевыми участками плазмиды из S. rochei. К концам "крепились" белки; видимо, с этих участков начиналась репликация ДНК, идущая от концов к центру линейной плазмиды. Однако в некоторых случаях линейные плазмиды могли реплицироваться с другой области, расположенной в центре плазмиды. Так, плазмида pSCL 1 из S. clavuligerus размером в 12 тпн могла быть клонирована в плазмиде Е. coli pUC 19, Если затем кольцевую химерную плазмиду выделяли из клеток Е. coli, то она реплицировалась в клетках актиномицетов как кольцевая молекула. Это свойство сохранялось и тогда, когда рестриктазами "обрезали" концевые части pSCL 1 и "закольцовывали" основную часть плазмиды лигазой. Видимо, второй ориджин репликации в нормальных условиях роста был критическим. Есть упоминание о том, что линейная плазмида pSA 1 под влиянием определенных мутаций может реплицироваться как коль­цевая структура; при этом ее копийность возрастает от I до 20 - 30 копий на клетку. Линейные плазмиды могли быть конъюгативными.

Все сказанное выше относилось в основном к небольшим плазмидам актиномицетов в 10…15 тпн. Однако наряду с ними в клетках актиномицетов существуют огромные плазмиды с линейной структурой: от 50 тпн (например, SLP 2) до 300…590 тпн (SCP 1 и ряд других плазмид; 26 - 28; 76). Одна из этих плазмид – SCP I – была известна гораздо раньше, но лишь недавно с применением пульс-фореза удалось показать ее линейную структуру и другие особенности строения. В поле пульс-фореза она вела себя как линейная дрожжевая хромосома сходных размеров; другим доказательством ее линейности служили расчеты с построением рестрикционной карты после применения целого спектра рестриктаз. Для этой и других гигантских плазмид характерна очень большая величина концевых участков с инвертированными повторами; у SCP 1 каждый концевой участок имел размер в 40 тпн, что в сумме составляло заметную часть всей длины плазмиды. Интересно, что у крупной линейной плазмиды SLP 2 правый концевой участок был практически полностью гомологичен обоим концам линейной хромосомы клетки, что вначале вызвало недоумение (три одинаковых концевых участка в клетке, обладающей лишь одной линейной хромосомой!). Однако затем была выявлена "плазмидная принадлежность" одного из этих концов. Гигантская плазмида SCP 1 может нести участки хромосомы, и участки этой плазмиды могут включаться в хромосому. При ее огромной величине ее копийность равняется приблизительно четырем копиям на клетку, что составляет ~20% плазмидной ДНК на клеточный геном.

И структура гигантских линейных плазмид актиномицетов, и некоторые другие их особенности делают довольно зыбкими границы между ними и собственно хромосомой. Об этом будет сказано ниже.

Линейные плазмиды были обнаружены и относительно хорошо изучены и у спирохет-боррелий. Однокопийные плазмиды В. burgdorferi и В. hermsii на электрофореграммах давали полосы, соответствующие линейной ДНК. Концевые участки линейной ДНК плазмид были нечувствительны к "объедающей" незамкнутые молекулы ДНК экзонуклеазе фага ?. Однако плазмида укорачивалась под действием нуклеазы Ва131, субстратом которой является однонитевая ДНК. При щелочной денатурации линейная ДНК плазмид образовывала однонитевые кольцевые структуры, непрерывность которых была подтверждена при электронном микроскопировании. Такие структуры не несли прикрепленных к ним белков: депротеинизация, за счет обработки протеазой К и затем фенолом не влияла на конфигурацию выделенных плазмид. Ренатурация денатурированной ДНК этих плазмид происходила очень быстро. Все это соответствовало тому, что плазмиды обладали линейной двунитевой ДНК, которая на концах образовывала однонитевые шпилечные структуры, ковалентно замкнутые сами на себя.

Сиквенс-анализ участков ДНК, примыкающих к "шпилькам", подтвердил эти выводы. Шпильки были образованы четырьмя неспаренными основаниями; к ним примыкала область с палиндромными структурами, богатая АТ-последовательностями. Левый и правый концы плазмиды pTL 16 из клеток В. burgdorferi были похожи друг на друга, хотя полной идентичности не было. Левый конец плазмиды pTL 49 из той же спирохеты был почти полностью идентичен левому концу pTL 16. Были исследованы также линейные плазмиды из других штаммов спирохет – возбудителей спирохетозов, передающихся клещами. Их концевые участки обладали разной степенью сходства с концами pTL 16; последовательность оснований в них предполагается даже считать одним из признаков, пригодных для классификации спирохет. На концевых участках были расположены гены главных белков внешней мембраны В. burgdorferi, Osp A, Osp В и Osp D; то же относится к генам поверхностных белков Vmps В. hermsii. Расположенный на линейной плазмиде ген В 29, кодирующий поверхностный липопротеин размером в 27 кДа, был клонирован в клетках Е. coli и хорошо экспрессировался в них.

Величина линейных плазмид спирохет была различной; наиболее изучены плазмиды pTL 16 и pTL 49 (соответственно в 16 и 49 тпн). Позже были обнаружены и более крупные линейные плазмиды, до 200 тпн. Они были обычно однокопийны и достаточно стабильны. В одной и той же клетке могли содержаться различные по величине линейные плазмиды. При обработке новобиоцином удалось "излечить" клетку от одной из таких плазмид, при сохранении другой. Наряду с линейными спирохеты могут содержать обычные кольцевые плазмиды. Так, в одном из штаммов В. burgdorferi содержались три разных однокопийных плазмиды: две линейных (16 и 49 тпн) и одна кольцевая (27 тпн). Все они были однокопийны.

Линейные плазмиды были обнаружены и у других бактерий. У фитопатогенной бактерии Rhodococcus fascians имеются большие линейные плазмиды, размером в 200 - 250 тпн. Одна из этих плазмид, pFiD 188, была конъюгативной, и на ней были расположены гены галлообразования. У другого вида родококков была изучена плазмида pHG 207 размером в 225 тпн. Плазмида несла белки, связанные с ее 5'-концами. Сиквенс терминальных областей показал высокую, но не абсолютную гомологию между обоими концами; каждый конец нес по области в 150 нуклеотидов с высоким содержанием АТ-пар оснований, что рассматривалось как косвенное доказательство нахождения области начала репликации в этом районе.

Некоторые штаммы Nocardia opaca также несли наряду с кольцевыми линейные плазмиды размером от 180 до 510 тпн. Плазмиды были конъюгативными, и на них могли располагаться гены растворимой гидрогеназы и рибулезо-бифосфаткарбоксилазы. Надо сказать, что были штаммы и лишенные плазмид.

Небольшая линейная плазмида pTAV 2 размером в 3,7 тпн была обнаружена у Thiobacillus versutus. Она несла на концах шпилечные структуры. Наконец, недавно была найдена линейная плазмида у представителя бацилл – Вас. polymyxa. Эта плазмида, pFS 1, размером в 16 тпн, несла белки, прикрепленные к 5'-концам. Плазмида была криптической.

Линейные репликоны бактерий – хромосомы и плазмиды – как вытекает из всего сказанного выше, обладают рядом общих свойств и могут быть разделены на две подгруппы. К одной из них относятся линейные структуры, несущие на конце белки (в основном линейные репликоны актиномицетов); к другой – линейные структуры, заканчивающиеся "шпильками" (в основном линейные репликоны некоторых спирохет). Репликация линейных молекул первого типа, видимо, начинается с концевых участков. Однако эти репликоны могут без потери жизнеспособности клетки быть превращены в истинные кольцевые структуры, неотличимые от кольцевых хромосом и плазмид; в этом случае начинает функционировать "запасной" ориджин репликации, похожий на такие же ориджины у большинства бактерий с кольцевыми хромосомами. Репликация линейных молекул второго типа начинается из центрального участка и распространяется в обоих направлениях, образуя пузыревидную структуру. Центральный участок также напоминает типичный бактериальный ориджин. Концевые участки у линейных репликонов обоего типа содержат множественные повторы и палиндромные структуры, в которых часто происходят делеции и перестройки. Обычно у одного и того же репликона оба концевых участка симметричны.

Концевые структуры линейных репликонов бактерий находят себе многочисленные аналогии среди теломеров – концевых участков хромосом – и других репликонов эукариот и вирусов. Это, прежде всего, относится к структурам, на которые похожи линейные репликоны актиномицетов. Сакагучи, впервые обнаруживший линейные плазмиды актиномицетов, назвал теломеры этого типа инвертронами. К ним он причисляет целый ряд плазмид дрожжей, грибов, растений; кроме того, сюда могут быть отнесены аденовирусы, бактериофаг ?29 В. subtilis и различные транспозоноподобные элементы. Для этого способа организации репликонов он предложил модель, напоминающую теннисную ракетку. Ручку ракетки образуют сложенные вместе концевые участки линейных структур, богатые повторами и палиндромами. Обе двуспиральные нити ДНК концевых участков удерживаются вместе за счет белков, принимающих участие в репликации. На самом конце ручки находятся белки, прикрепленные к 5'-концам. Репликация, инициируемая концевым белком, начинается с одной из нитей, и "обегает" всю структуру; после этого реплицируется другая нить (так называемая заместительная репликация).

Структуры, подобные линейным репликонам спирохет-боррелий, также не уникальны. Так ус­троены геном вируса африканской лихорадки свиней и геном группы вирусов, вызывающих оспу и сходные заболевания. Любопытно, что и некоторые боррелии, и возбудитель африканской лихорадки свиней передаются одним и тем же переносчиком – клещом Ornitodorus moubata. GC-состав ДНК боррелий и вируса африканской лихорадки свиней сходны. Это позволило, в качестве одного из допущений, предположить, что в основе такого сходства лежит генетический обмен между упомянутым выше вирусом и плазмидами боррелий, совершающийся в организме клеща-переносчика. Другим объяснением является конвергентная эволюция вирусного и плазмидного геномов. Однонитевая ДНК, заканчивающаяся шпилечными структурами, характерна для митохондрий инфузорий, некоторых линейных плазмид дрожжей и пластид хлоропластов ячменя.

На наш взгляд, примечателен тот факт, что бактериям с линейными хромосомами часто со­путствуют и линейные плазмиды, причем того же типа, что и хромосомы. Трудно сказать, случайное ли это совпадение или оно отражает какие-то закономерности, например, оптимальный для данной группы бактерий способ репликации ДНК. Может быть, в случае актиномицетов, когда концевые участки гигантских линейных плазмид могут быть гомологичны концевым участкам линейной хромосомы, нельзя исключить рекомбинационное происхождение такого сходства.



БАКТЕРИИ МОГУТ ИМЕТЬ БОЛЬШЕ ОДНОЙ ХРОМОСОМЫ НА КЛЕТКУ

Одно из основных положений генетики бактерий – утверждение, что бактериальная клетка гаплоидна, и несет только одну хромосому на клеточный эквивалент (см. выше). Однако и здесь, как и в уже рассмотренных разделах, накапливаются данные, опровергающие универсальность этого положения. Во-первых, даже у классических объектов бактериальной генетики – Е. coli и Вас. subtilis – бактерии в стадии активного роста обычно содержат от двух до восьми нуклеоидов на клетку; эти нуклеоиды находятся под одной клеточной оболочкой. В процессе споруляции бацилл в одной клетке содержатся, как правило, два нуклеоида – материнской клетки и образующейся споры. Таким образом, правильнее было бы говорить о преходящем гаплоидном и полигаплоидном состояниях бактериальной клетки. Далее по мере расширения круга моделей стали появляться данные о бактериях, геном которых состоит, по меньшей мере, из двух различных хромосом. У некоторых бактерий при рестриктном анализе и пульс-форезе ДНК стали обнаруживать по несколько огромных репликонов на клетку, причем каждый был строго определенной величины. Возникал вопрос о том: что это – разные хромосомы, или хромосома и мегаплазмиды? Критерием того, что меньший по размеру ;репликон был все же второй хромосомой, служила локализация на нем жизненно важных для «клетки, типично "хромосомных" генов; отсутствие клеток, не несущих этот репликон; строгий контроль распределения между клетками хромосомоподобных репликонов.

Наиболее изученными в этом отношении оказались бруцеллы и близкий к ним микроорганизм Rhodobacter sphaeroides. В клетках родобактера с помощью рестрикционного анализа и пульс-фореза было найдено два очень больших репликона, размером в 3?10⁶ и 0,9?10⁶ пн. Можно было думать, что это – хромосома и мегаплазмида; однако некоторые соображения говорили о наличии именно двух хромосом – большой и малой. Так, оба репликона несли гены рибосомной РНК, причем разные. Эти гены были необходимы для роста клеток. Постоянное наличие этих репликонов в клетке также свидетельствовало в пользу их хромосомной природы.

Изучению физическими методами генома бруцелл способствовало то, что у этих патогенных микроорганизмов не известны мутанты по ростовым потребностям, и не описана трансформация, трансдукция и конъюгация. Поэтому работы по генетике бруцелл в значительной мере сводились к составлению физических карт их хромосомы. Вначале размеры генома В. melitensis были определены в 3,1?10⁶ пн, и считалось, что вся ДНК входит в состав лишь одной кольцевой хромосомы. Однако через 2 года была опубликована статья тех же авторов, в которой было показано, что употребление других крупнощепящих рестриктаз и пульс-фореза, позволило обнаружить два кольцевых репликона (размер – 2,1?10⁶ и 1,15?10⁶ пн). Использование нативной ДНК в пульс-форезе показало наличие двух полос, соответствующих этим репликонам. Такие же данные были получены и для других видов бруцелл – В. abortus, В. suis, В. ovis. За счет гибридизации с ранее клонированным генами бруцелл, а также с некоторыми консервативными генами, общими для всех бактерий, было установлено, что опероны рибосомной РНК и гены теплового шока располагаются на обоих репликонах. Это позволило считать их разными хромосомами.

Имеются данные о наличии в клетке двух различных хромосом и у других бактерий. У Agrobacterium tumefaciens при применении пульс-фореза нашли 4 репликона: Ti-плазмиду (200 тпн), криптическую плазмиду (450 тпн) и две очень больших молекулы ДНК (2,1?10⁶ и 3?10⁶ пн). Меньшая из них была линейной, большая – кольцевой, и не входила в гель при пульс-форезе без искусственно вызванных разрывов. Жизненно важные гены 16S-рибосомной РНК и ряд генов, определяющих белковый синтез, локализовались на обоих больших репликонах. Таким образом, у данной бактерии было две хромосомы - кольцевая и линейная. Структура линейной хромосомы не изучалась. Не было ясно, как совмещается механизм репликации кольцевой и линейной хромосом в одной и той же клетке. Две кольцевых хромосомы на клетку обнаружили и у возбудителя желтухи Leptospira interrogans (4,5?10⁶ и 0,35?10⁶ пн). Собственно, меньший репликон был обнаружен раньше, но считался мегаплазмидой. В цитируемой работе изучали расположение генов с "фун­даментальными" функциями, за счет гибридизации ДНК обоих репликонов лептоспир с клони­рованными ранее "консервативными" генами других бактерий. На большом репликоне располагались гены dig A, gyr BA, dna А, причем они лежали в одном участке, видимо, соответствующем области начала репликации. На малом репликоне лежал ген asd, существенный для синтеза аминокислот. Поскольку его функция была необходима для существования клетки, то и малый репликон мог считаться хромосомой, хотя и неясно, по каким механизмам шла его репликация. Вполне вероятно, что при дальнейшем изучении мегаплазмид у ряда бактерий они на самом деле окажутся хромосомами.

Три кольцевых репликона на клетку, которые также могут считаться хромосомами, обнаружили, применяя обработку крупнощепящими рестриктазами и пульс-форез, у одного из штаммов Pseudomonas cepacia. Их размер соответственно: 3,4?106; 2,5?106 и 0,9?106 пн. Во всех этих репликонах находились гены рРНК; кроме того, на первых двух репликонах лежали гены биосинтеза ряда аминокислот: изолейцина, аргинина, гистидина, треонина и лизина, что доказывалось получением ауксотрофных мутантов. У этой же бактерии существовала кольцевая криптическая плазмида размером 170?106 пн.

Кроме микроорганизмов, упомянутых выше, мегаплазмиды описаны и у других бактерий; огромной величины – до 1,7?106 пн – они достигают у Rhisobium meliloti. Примечательно, что R. meliloti, Rhodobacter, Brucella и A. tumefaciens близко расположены друг к другу по классификации, основанной на сиквенсе 16S-PHK.

Выше упоминалось о состоянии "преходящей полиплоидии" у интенсивно растущих бактерий; имеются виды, у которых число эквивалентов хромосом на клетку очень велико. Так, у Azotobacter chroococcum в экспоненциальной фазе роста на одну клетку приходится 20…25 хромосом-нуклеоидов. У родственного вида A. vinelandii также предполагается наличие большого количества кольцевых хромосом на клетку, 9…17 хромосом на клетку приходится у Desulfovibrio gigas. Следует остановиться на организации генома у радиоустойчивой бактерии Deinococcus radiodurans. У нее, по-видимому, каждый нуклеоид содержит 4 хромосомы в стационарной фазе и 8…10 хромосом в экспоненциальной фазе роста. Полиплоидия здесь – гораздо более стабильное состояние, чем, например, наличие нескольких нуклеоидов на еще не разделившуюся клетку Е. coli в интенсивно растущей культуре. Возможно, что такими особенностями генома и обусловлена высокая радиорезистентность у этого микроорганизма.



ВПЕРЕДИ – НОВЫЕ СЮРПРИЗЫ?

Геном бактерий наверняка принесет исследователям и другие неожиданности. Это касается, в частности, его величины (да и вообще величины бактериальной клетки). Одной из бактерий наи­меньших размеров считается Mycoplasma genitalis, вызывающая не-гонорройные уретриты, с диаме­тром около 0,2…0,3 мкм; величина ее хромосомы, по данным, полученным с применением пульс-фореза, – 577…590 тпн. Средние, "стандартные" для бактерии размеры имеет Е. coli (длина клетки 2…3 мкм, размер хромосомы – 4,7?10⁶ пн). Однако среди бактерий описаны и настоящие гиганты. Так, из кишечника некоторых морских тропических рыб выделили симбиотическую бактерию Epilopiscium fishelsoni, принятую вначале за простейшее. Ее клетка достигает длины 576 мкм (более полумиллиметра!) с поперечником ~200 мкм. Это существо, хорошо видимое невооруженным глазом, относят к бактериям по ряду признаков: составу рибосомной РНК, микроскопическому строению нуклеоида, особенностям строения жгутиков. К сожалению, пока что не подобрали условий для культивирования этой бактерии на искусственных питательных средах. Если величина ее нуклеоида так же относится к размерам клетки, как у кишечной палочки, то она содержит 1400?106 пн ДНК!

Нуклеотидный состав бактериальной хромосомы оказалось возможным изменить, причем радикальным образом: заменив около 93…96% тиминовых оснований на урацильные. Для этого был использован штамм Е. coli, который нес ряд М-мутаций пуринового и пиримидинового синтеза, и при 42 °С синтезировал ДНК измененного состава. Правда, после того как количество ДНК увеличивалось в 1,6…1,9 раза, а клеточная масса – в 1,7…2,7 раза, рост останавливался, и клетки затем погибали. Можно напомнить, что и геном фага PBS 2 Вас. subtilis содержит урацил вместо тимина.

Наконец, после полного секвенирования генома основных бактерий-моделей, можно ожидать существенного пополнения данных об участии в формировании хромосомы бактерий внехромосомных репликонов. Уже давно было известно, что в состав бактериальной хромосомы могут входить геномы умеренных фагов. Наиболее изученным вариантом такого взаимодействия является лизогенизация после заражения бактерии умеренным фагом, с включением фагового генома в строго определенные участки хромосомы (например, фаг Х Е. coli), или включение в участки с самой различной локализацией (фаг Ми Е. coli). После индукции, вызванной самыми различными воздействиями, профаг может выщепляться из хромосомы, образуя полноценные фаговые частицы. Существуют примеры и более тесного "сожительства" фага и бактерии, когда добиться ^выщепления генома умеренного фага из хромосомы гораздо труднее, и большинство бактериальных штаммов из разных коллекций всегда несет в определенном участке хромосомы профаг (например, фаги ?105 и SP? Вас. subtilis). Следующий этап интеграции генома фагов в хромосому – так называемые дефектные фаги, когда при индукции образуются неполноценные фаговые частицы, не несущие своей ДНК и не способ­ные к заражению новой бактериальной клетки (фаг PBSX и другие фаги этой группы у Вас. subtilis и близкородственных бацилл). Воспроизведение фагового генома здесь возможно лишь в составе реплицирующейся бактериальной хромосомы, а способность к продуктивной инфекции потеряна. Дальнейшим примером интеграции, приводящей к полной ассимиляции генома фага бактериальной хромосомой, являются бактерии с мутациями, исключающими всякую индукцию профага. В этом случае фаговый геном остается навсегда "замурованным" в хромосоме, и его ДНК, видимо, может служить материалом для возникновения новых бактериальных генов. В некоторых случаях оказывалось, что те или иные гены на самом деле являются фаговыми (например, некоторые гены тиминового метаболизма у Вас. subtilis). Можно предположить, что некоторые хромосомные гены, детерминирующие синтез аутолитических ферментов у бацилл, также исходно гены дефектных фагов.

Вероятно, подобные ситуации возможны и в отношении плазмид. Так, в хромосоме некоторых штаммов Вас. subtilis существует участок или участки, гомологичные стафилококковой плазмиде pUBl10. Эта гомология выявлялась случайно при гибридизации плазмидной ДНК и хромосомы бактерии. В известных условиях возможно возникновение в клетке Вас. subtilis de novo плазмиды, в значительной мере гомологичной pUBl10; появление такой плазмиды было недавно обнаружено в нашей лаборатории. Данные, которые также поддаются такой трактовке, были получены и другими исследователями. Можно допустить, что "проплазмиды", как и профаги, встречаются в составе бактериальной хромосомы более или менее регулярно. Включение плазмид в состав хромосомы достигается за счет незаконной рекомбинации, или каких-то других механизмов. Выявлению таких "молчащих" структур будет весьма способствовать полный сиквенс бактериальных хромосом.